1. معرفی

پودر آرتمیزینین طبیعی 63968-64-9 یک گیاه دارویی است که بیش از 2000 سال در طب سنتی چینی برای درمان بسیاری از اختلالات از جمله مالاریا استفاده می شود. آرتمیزینین جزء اصلی عصاره درمنه است. جداسازی آرتمیسینین از Artemisia annua L. و مشخص کردن اثر ضد مالاریا آن در دهه 1970 توسط دانشمندان چینی آغاز شد که به عنوان یکی از مهمترین پیشرفت ها در کنترل مالاریا در دوران مدرن تلقی می شود. پودر آرتمیزینین به طور گسترده در زمینه مواد غذایی، دارویی و آرایشی استفاده می شود.

آرتمیزین یک ترکیب آلی با فرمول مولکولی C15H22O5 و وزن مولکولی نسبی 282.34 است. [1]

آرتمیزینین یک کریستال سوزنی بی رنگ با نقطه ذوب 156 تا 157 درجه است. به راحتی در کلروفرم، استون، اتیل استات و بنزن محلول، محلول در اتانول و اتر، کمی محلول در اتر نفتی سرد و تقریباً نامحلول در آب است. به دلیل داشتن گروه پراکسی خاص، در برابر حرارت ناپایدار بوده و تحت تأثیر رطوبت، گرما و مواد کاهنده به راحتی تجزیه می شود. [1]

آرتمیزینین موثرترین دارو برای درمان مقاومت دارویی مالاریا است. درمان ترکیبی مبتنی بر آرتمیزینین نیز در حال حاضر موثرترین و مهم ترین وسیله برای درمان مالاریا است. اما در سال‌های اخیر با تعمیق تحقیقات، اثرات دیگری از آرتمیزینین نیز بیشتر و بیشتر کشف و مورد استفاده قرار گرفته است، مانند ضد تومور، درمان فشار خون ریوی، ضد دیابت، سمیت جنینی، ضد قارچ، تنظیم ایمنی، ضد ویروسی [{{ 1}}]، ضد التهاب، ضد فیبروز ریوی، اثرات ضد باکتریایی، قلبی عروقی و سایر اثرات فارماکولوژیک [2].

در اکتبر 2015، تو یویو به همراه دو دانشمند دیگر جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی 2015 را به دلیل مشارکت در ساخت داروهای جدید ضد مالاریا - آرتمیزینین و دی هیدروآرتمیزینین، برد. [5

پیشینه تحقیق

مالاریا یکی از قدیمی ترین بیماری های انسان است و هنوز هم یک مشکل مهم بهداشت عمومی است که به طور گسترده در جهان نگران است و باید فوراً حل شود.

در سال 1631، مبلغ ایتالیایی آگوستینو سالومبرینو، داروی مؤثری برای درمان تب از مردم پرو در آمریکای جنوبی به نام cinchonabark به دست آورد و آن را برای درمان تب به اروپا بازگرداند. به زودی مشخص شد که این دارو اثر تسکین آشکاری بر تب متناوب دارد.

در سال 1820، پیر ژوزف، شیمیدان فرانسوی، و جوزف بینایم کاونتو، دانشمند داروسازی، ماده مؤثر برای درمان مالاریا را از پوست درخت سینچونا جدا کردند و آن را کینین نامیدند.

در سال 1944، شیمیدانان آلی آمریکایی رابرت وودوارد و ویلیام دورینگ برای اولین بار با موفقیت گنه گنه را سنتز کردند. از آن زمان به بعد، دانشمندان به طور مداوم داروهای ضد مالاریا را بهبود بخشیده اند و متانول های معطر و هتروسیکلیک به نمایندگی از کینین، 4-آمینوکینولین ها با کلروکین و آمینو فنل های هتروسیکلیک به نمایندگی از آمودیاکین تشکیل شده اند. این داروهای ضد مالاریا نقش مهمی در کنترل مالاریا در انسان ایفا کرده اند. اما با استفاده گسترده و طولانی مدت از داروها، به تدریج مشکل مقاومت دارویی انگل های مالاریا مطرح شده است.

در اوایل دهه 1960، پلاسمودیوم فالسیپاروم در برخی مناطق، به ویژه در آسیای جنوب شرقی، مقاومت در برابر کلروکین ایجاد کرد. در آن زمان، با تشدید تدریجی جنگ ویتنام، حمله مالاریا فالسیپاروم مقاوم به کلروکین، طرف های متخاصم را گرفتار کرد و در نتیجه تعداد زیادی از نیروهای رزمی کاهش یافت. برای این منظور، ایالات متحده منابع انسانی و مادی زیادی را برای مطالعه مالاریا با هدف اصلی یافتن داروهای جدید ضد مالاریا سرمایه گذاری کرده است. در میان آنها، موسسه تحقیقات ارتش والتر رید ایالات متحده بیش از 200000 ترکیب را از اواخر دهه 1960 غربالگری کرده است. به دلیل شرایط محدود، ویتنام قادر به تولید داروهای جدید نیست، بنابراین از چین برای حل مشکل کنترل مالاریا کمک خواست. طرف چینی با درک فوریت و پیچیدگی کنترل مالاریا، محققانی را برای انجام تحقیقات میدانی و کمک های میدانی برای نزدیک به دو سال اعزام کرده است.

کشف آرتمیسینین

از 21 می تا 1 ژوئن 1971، سمپوزیوم ملی کنترل و پیشگیری از مالاریا در گوانگژو برگزار شد. پس از سمپوزیوم، موسسه طب سنتی چینی پکن تیم تحقیقاتی را سازماندهی مجدد کرد. تو یویو همچنان رهبر تیم بود و اعضای تیم ژونگ یورونگ به استخراج طب سنتی چینی ادامه دادند. لانگ لینفو و لیو جوفو آزمایشاتی روی حیوانات انجام دادند. با توجه به سوابق غربالگری دارویی موسسه طب سنتی چینی پکن، میزان مهار آرتمیسینین 12 درصد در 26 ژوئیه 1971 (شماره 16)، 40 درصد در 1 سپتامبر (شماره 114) و 100 درصد در 4 اکتبر بود. (شماره 191). از ژانویه 1971، تیم Tu Youyou شروع به استخراج مقدار زیادی از عصاره اتری درمنه آنوآ کرد و آزمایش سمیت روی سگ ها را در پایان ژوئن همان سال به پایان رساند. به منظور انجام کارآزمایی بالینی در اسرع وقت، در حالی که نتایج آزمایش سمیت عصاره آرتمیزینین اتر روی سگ ها در آن سال هنوز بحث برانگیز است، تو یویو، لانگ لینفو، یو فنگشیان و ژانگ گووژن، یان شوچانگ، پان هنجیه Zhao Aihua و Fang Wenxian به طور متوالی عصاره خنثی آرتمیزینین اتر را در دو دسته در دوزهای مختلف، بدون عوارض سمی و جانبی آشکار مصرف کردند.

در 8 مارس 1972، تو یویو، به عنوان نماینده موسسه طب سنتی چینی پکن، گزارشی با عنوان "استفاده از اندیشه مائو تسه تونگ برای هدایت اکتشاف داروهای گیاهی چینی ضد مالاریا" در جلسه "دفتر ملی 523" ارائه کرد. در نانجینگ، و نتایج نرخ مهار 100 درصدی مالاریا موش و مالاریا میمون عصاره خام خنثی آرتمیزینین اتر را گزارش کرد که توجه همه شرکت کنندگان را به خود جلب کرد. با توجه به داده ها، تو یویو از طب سنتی چینی و ضرب المثل عامیانه "آب شیره" الهام گرفته شده است. با توجه به اینکه ترکیبات موثر ممکن است در قسمت چربی دوست باشد، او به استخراج اتر تغییر کرد که به طور قابل توجهی قدرت حیوانی درمنه آنوآ را از 30 درصد به 40 درصد به بیش از 95 درصد بهبود داد.

در آگوست 1972، تو یویو تیمی را برای انجام آزمایش اثربخشی بالینی عصاره خنثی آرتمیزینین اتر در جزیره هاینان رهبری کرد. در این دوره، Ni Muyun پیش تیمار جداسازی ستون کروماتوگرافی را برای بهبود مجدد اثر ضد مالاریا قسمت خنثی عصاره اتری درمنه آنوآ طراحی کرد. ژونگ یورونگ از ادبیات دریافت که ستون سیلیکاژل در جداسازی ترکیبات خنثی مؤثرتر است، بنابراین او و دستیارش کوی شولیان از کروماتوگرافی ستونی سیلیکاژل و شستشوی گرادیان نفت اتر-اتیل اتر (که بعداً به اتر نفت-اتیل استات تغییر یافت) استفاده کردند. به روش ارائه شده در ادبیات برای جداسازی عصاره اتر خنثی بر اساس درمان پیش ستونی Ni Muyun.

در 8 نوامبر 1972، ستون سیلیکاژل تولید شده توسط کارخانه معرف شانگهای برای جداسازی مورد استفاده قرار گرفت و سپس از اتر نفت و اتیل استات-پترولیوم اتر (نسبت های مختلف) برای شستشو برای دفعات استفاده شد. ابتدا مقدار کمی از کریستال های سوزن مانند به دست آمد که شماره آنها "کریستال سوزنی I" (شماره 1 یا سوزن 1) بود. تعداد کریستال های سوزن مانندی که بعداً شسته می شوند "کریستال سوزنی II" (شماره 2 یا سوزن 2) است. بعداً کریستال مربع دیگری با شماره "کریستال III" (شماره 3 یا کریستال مربع) بدست آمد. در آغاز دسامبر همان سال، آزمایش مالاریا در موش ثابت کرد که "کریستال سوزنی II" تنها مونومر موثر با اثر ضد مالاریا است. از آن زمان، هنگامی که مؤسسه طب سنتی چینی پکن به «دفتر ملی 523» گزارش داد، ماده مؤثر ضد مالاریا «کریستال سوزنی II» را به «آرتمیسینین II» تغییر داد، که گاهی به آن آرتمیزینین نیز می‌گویند. بعدها، موسسه طب سنتی چینی پکن "آرتمیسینین II" را آرتمیسینین نامید.

2. عملکرد اصلی

1. ضد مالاریا، پودر آرتمیزینین دارای اثر کشنده بر روی انگل در گلبول های قرمز خون است، می تواند بلوغ انگل را به سرعت مهار کند.

2. ضد باکتری، آرتمیسینین دارای اثر ضد ویروس آنفولانزا است.

3. ضد انگل، آرتمیزینین بر نقش ضد شیستوزومیازیس و لپتوسپیروز.

3. کاربرد

1. پودر آرتمیسینین طبیعی 63968-64-9 که در زمینه مواد غذایی استفاده می شود، پودر آرتمیسینین می تواند به عنوان مواد خام چای برای کاهش خلط عمل کند.

2. کاربرد در زمینه دارویی، به یک داروی جدید ضد سرطان با سمیت کم تبدیل می شود.

3. کاربرد در زمینه آرایشی، می تواند گردش خون را تقویت کرده و نوشیدنی را حذف کند.

4. مشخصات

موارد	الزامات	نتایج
شرح
ظاهر:	پودر کریستالی سفید تا مایل به سفید.	مطابقت دارد
انحلال پذیری	محلول آزاد در استون و اسید استیک یخچالی، محلول در متانول، اتانول، اتانول رقیق، اتر یا اتر نفتی که عملاً در آب نامحلول است	مطابقت دارد
نقطه ذوب	150-153 درجه	150.9-151.8 درجه
نوری خاص چرخش	به علاوه 75 درجه - به علاوه 78 درجه	به اضافه 77.1 درجه
شناسایی
واکنش رنگ	رنگ بنفش تولید می شود	مطابقت دارد
واکنش رنگ	رنگ بنفش مایل به قرمز تیره تولید می شود	مطابقت دارد
HPLC	زمان ماند پیک اصلی در آماده سازی آزمون باید مطابق با استاندارد کاری که از روش آزمایش HPLC به دست آمده است	مطابقت دارد
IR	طیف IR نمونه باید باشد مطابق با طیف IR استاندارد کاری آرتمیزینین	مطابقت دارد
تست ها
مواد مربوط (HPLC)	آرتمیزیتن کمتر یا مساوی 0.15 درصد {{0}}اپیمر آرتمیزینین کمتر یا مساوی 0.3 درصد هر ناخالصی فردی کمتر یا مساوی {{0}}.15 درصد کل ناخالصی ها کمتر یا مساوی 1.0 درصد	{{0}}.07 درصد NA 0.1 درصد 0.75 درصد

5. نمودار جریان

مواد اولیه → تمیز کردن → سقوط → عصاره → فیلتر → کنسانتره → خشک اسپری → آزمایش → بسته بندی

سنتز شیمیایی

سنتز آرتمیزینین از R - ( پلاس ) - سیترونلال

سنتز آرتمیزینین از R - (+) - سیترونلال [11]

در سال 1983، شیمیدان HofheinzW و دیگران روش سنتز شیمیایی آرتمیزینین را از طریق تحقیقات شیمیایی کشف کردند. با استفاده از (-) - 2-ایزوبوتانول به عنوان ماده اولیه، ماده واسطه با وارد کردن گروه‌های اکسیژن از طریق واکنش اکسیداسیون نوری به دست آمد و سپس محصول نهایی از طریق واکنش چرخه‌سازی سنتز شد. دو مرحله اصلی محدود کننده سرعت در سنتز لاکتون‌های سسکوئی‌ترپن وجود دارد: تاشو و چرخه‌شدن هسته‌های اصلی سسکوئی‌ترپن. فرآیند تشکیل لاکتون های سسکوئی ترپن حاوی پل های پراکسی.

در سال 1986، دانشمند چینی ژو ویشان آرتمیزینین را از R - ( پلاس ) - سیترونلال سنتز کرد. با این حال، به دلیل مراحل سنتز پیچیده و بازده کل پایین، حتی کمتر از 1 درصد، ارزیابی امکان‌سنجی صنعتی‌سازی هنوز محقق نشده است.

بیوسنتز

آرتمیسینین در گل ها و برگ های گیاه دارویی چینی Artemisia annua وجود دارد، اما در ساقه ها وجود ندارد. این یک ترکیب ترپن با محتوای بسیار کم است و مسیر بیوسنتزی آن بسیار پیچیده است.

اکنون مشخص شده است که بیوسنتز آرتمیزینین را می توان به سه روش انجام داد. یکی افزایش محتوای آرتمیزینین با تنظیم آنزیم های کلیدی کنترل کننده بیوسنتز آرتمیزینین و افزودن پیش سازهای بیوسنتز است. دوم این است که ژن های کنترل شده توسط آنزیم های کلیدی را فعال کند و محتوای آرتمیزینین را به میزان قابل توجهی افزایش دهد. سومین مورد استفاده از مهندسی ژنتیک برای تغییر ژن‌های کلیدی به منظور افزایش کارایی آنزیم‌هایی است که کنترل می‌کنند.

در فرآیند بیوسنتز، محتوای آرتمیزینین به شدت تحت تأثیر عوامل فیزیولوژیکی و اکولوژیکی مانند نور، هورمون های برون زا، تمایز جوانه ها و ... قرار می گیرد و دما نیز تأثیر زیادی در بیوسنتز دارد. از طریق تحقیقات تجربی، مشخص شد که میزان آرتمیزینین نهال آرتمیزینین پس از 36 ساعت تیمار در دمای 40 درجه به 68 درصد افزایش می یابد.

علاوه بر آرتمیسینین، گیاهان دیگر نیز می توانند آرتمیسینین را سنتز کنند. در سال 2011، محققان آرتمیسینین را از تنباکو سنتز کردند. در مقایسه با روش‌های شیمیایی سنتی، معرف‌های شیمیایی مورد استفاده در این روش بسیار کاهش می‌یابد که برای حفاظت از محیط زیست مفید است. گیرنده این روش بیوسنتز تنباکو است که در چین نسبتاً گسترده است. بنابراین منبع مواد اولیه نسبتاً غنی است. با این حال، برخی از بسترهای واکنش در فرآیند سنتز آرتمیزینین از تنباکو مشخص نیستند و نیاز به توسعه دارند. با این حال، این روش مصنوعی هنوز هم چشم انداز کاربرد صنعتی خوبی دارد. [11]

یک ژن آرتمیزینین در اشریشیا کلی کاشته می شود و اشرشیاکلی تبدیل شده یک ترکیب میانی تولید می کند که می تواند پس از چندین مرحله درمان به ماده خام آرتمیزینین تبدیل شود - اسید آرتمیزینین. پس از قرار دادن یک آنزیم خاص در مخمر، مخمر ترکیب میانی ذکر شده در بالا را به آرتمیزینین تبدیل کرد. زنجیره تکنولوژیکی تولید آرتمیسینین از طریق صنعت میکروبی اساسا شکل گرفته است. این بدان معناست که قیمت آرتمیسینین 90 درصد کاهش می یابد. [12]

استخراج و تصفیه

فرآیندهای جداسازی و خالص سازی عمدتاً شامل استخراج به کمک حلال، تبلور مجدد استخراج، استخراج CO2 فوق بحرانی و کروماتوگرافی استخراج با حلال است.

روش استخراج و تبلور مجدد با حلال به طور کلی از روش بنزین با حلال، روش اتانول و استخراج آب قلیایی و روش رسوب اسیدی برای تولید استفاده می کند که به طور قابل توجهی میزان استفاده موثر از گیاهان آرتمیزینین را افزایش می دهد.

روش استخراج آب قلیایی و رسوب اسیدی: مقدار مشخصی پودر خشک شاخه و برگ درمنه را گرفته و برای هم زدن و استخراج به اتانول اضافه کنید تا محلول استخراج اتانول به دست آید، آن را با فشار کم خشک کرده و در اتر حل کنید. محلول آب دو فاز برای به دست آوردن آرتمیسینین و آرتمیسینین به ترتیب. بازده آرتمیزینین در این روش 90 درصد و میزان استخراج آرتمیسینین 57 درصد است.

روش اتانولی: مقدار مشخصی پودر خشک شده شاخه و برگ درمنه را گرفته و به مدت 24 ساعت در اتانول رقیق خیس کنید و عصاره اتانولی را بدست آورید و به دستگاه استخراج مداوم تزریق کنید و سپس با بنزین حلال حاوی بنزن و اتیل استخراج کنید. استات برای به دست آوردن فاز الکل و فاز استخراج که قابل بازیافت است، فاز استخراج با کربن فعال رنگ‌آمیزی می‌شود، فیلتر می‌شود و حلال بازیابی می‌شود و سپس محلول غلیظ به دست می‌آید و سپس خنک و متبلور می‌شود تا کریستال درشت به دست آید. آرتمیزینین و سپس با اتانول تبلور مجدد کنید تا آرتمیزینین نهایی بدست آید. این روش دارای مزایای بازده بالا، هزینه کم، مراحل کمتر، عملیات ساده و ایمنی است.

روش بنزین حلال: مقدار مشخصی پودر خشک شاخه و برگ درمنه را برداشته و 8 تا 10 بار در بنزین 120 # حلال به مدت 3 بار خیس کنید و عصاره بنزین حلال را بگیرید سپس آن را از حالت فشرده خارج کرده و غلیظ کرده و برای تبلور قرار دهید. آرتمیسینین خام را بگیرید و با مقدار کمی بنزین حلال 120 # برای دفعات بشویید و 2 تا 3 بار الکل اتانول 50 درصد را متبلور کنید و در نهایت کریستال سوزنی سفید آرتمیسینین را بگیرید. این روش ساده و آسان برای استفاده در تولید انبوه است.

سه روش استخراج برای کروماتوگرافی استخراج با حلال وجود دارد که عبارتند از، کروماتوگرافی ستونی استون - سیلیکاژل، بنزین کم جوش - کروماتوگرافی سیلیکاژل منبسط شده کروی بسیار کوتاه و استخراج اتان - اتان / استونیتریل - کروماتوگرافی ستونی سیلیکاژل.

6. صلاحیت

پس از سال ها تولید، شرکت ما مجوز تولید مربوطه را دریافت کرده است.

ISO